蛋白经胰酶消化形成的肽段进入质谱，一级质谱检测多肽分子的大小，然后再将肽段打碎，形成一系列离子即N端离子系列（B系列）和C端碎片离子系列（Y系列）。质谱再检测碎片离子的大小，即二级质谱。将质谱数据与蛋白数据库进行比对，获得肽段的序列，特定的多肽序列对应着特定的蛋白，从而鉴定出待检测蛋白。